USPTO Patents Application 10551504

esp@cenet — Bibliographic data

Page 1 of 1

Multivalente Antikdrper-Konstrukte

Publication number:
Publication date:
Inventor(s):
Applicant(s):
Classification:
- international:

- European:
Application number:
Priority number(s):

DE19819846 (A1)
1999-11-11

LITTLE MELVYN [DE]; KIPRIYANOV SERGEJ [DE]
DEUTSCHES KREBSFORSCH [DE]

G01N33/53; A61K39/395; C07K14/82; C07K16/00;
C07K16/28; C12N15/09; G01N33/531; G01N33/53;
A61K39/395; C07K14/82; C07K16/00; C07K16/18;
C12N15/09; G01N33/531 ; (IPC1-7): G01N33/569;
G01N33/574; C07K16/00; A61K39/395; C12N15/63

C07K14/82; C07K16/28A; C07K16/28A12; G01N33/531

DE19981019846 19980505

DE19981019846 19980505

Also published as:

US7129330 (B1)
US2007031436 (A1)
US7507796 (B2)
JP2002513805 (T)
ES2296395 (T3)

more »

Cited documents:

W09119739 (A1)

Abstract of DE 19819846 (A1)

The invention relates to a multivalent Fv antibody
construct comprising at least four variable domains
which are connected to one another via peptide
linkers 1, 2 and 3. The invention also relates to
expression plasmids which code for such an Fv
antibody construct. In addition, the invention relates
to a method for producing the Fv antibody
constructs and to the use thereof.

A

'VwmV

Data supplied from the esp@cenet database — Worldwide

hto://v3.espacenetxom/publicationDetails/biblio?adjacent==true&KC=Al&date=19991 1 1 1&NR=19819... 6/1 1/2009

® BUNDESREPUBLIK
DEUTSCHLAND

DEUTSCHES
PATENT- UIMD
MARKENAMT

® Offenlegungsschrift
DE 19819 846 A1

@ Aktenzeichen:
© Anmeldetag:
@ Offenlegungstag:

198 19 846.9
5. 5.98
11. 11.99

© Int. CI. 6 :

C 07 K 16/00

A 61 K 39/395
C 12 N 15/63
// GO 1N 33/569,
33/574

CO

00
0)

00

o

@ Anmelder:

@ Erfinder:

Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des

Little, Melvyn, 69151 Neckargemiind, DE;

offentlichen Rechts, 69120 Heidelberg, DE

Kipriyanov, Sergej, 69121 Heidelberg, DE

® Vertreter:

© Entgegenhaltungen:

Patentanwalte Dr. Bernard Huber, Dr. Andrea

WO 91 19 739

Schiifcler, 81825 Miinchen

CA 119:157915a;

CA 126:130370a;

Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen

Prufungsantrag gem. § 44 PatG ist gestellt
© Multivalente Antikorper-Konstrukte

© Die vorliegende Erfindung betrifft ein multivalentes F v -
Antikorper-Konstrukt mit mindestens vier variablen Do-
manen, die uber die Peptidlinker 1, 2 und 3 miteinander
verbunden sind. Ferner betrifft die Erfindung Expressi-
onsplasmide, die fur ein solches F v -Antik6rper-Konstrukt
codieren, und ein Verfahren zur Herstellung der F v -Anti-
korper-Konstrukte sowie deren Verwendung.

BUNDESDRUCKEREI 09.99 902 045/241/1

22

DE 198 19

l

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft multivalente F v - Anti-
korper- Konstrukte, sie kodierende Expressionsplasmide,
und ein Verfahren zur Herstellung der F v - Antikorper- Kon- 5
strukte sowie ihre Verwendung.

Natiirliche Antikorper sind Dimere und werden daher als
bivalent bezeichnet. Sie weisen vier variable Domanen,
namlich zwei Vh- und zwei VL-Domanen, auf. Die varia-
bles Domanen dienen als Bindungsstellen fur ein Antigen, 10
wobei eine Bindungsstelle aus einer V H - und einer Vl-Do-
mane ausgebildet ist. Natiirliche Antikorper erkennen je-
weils ein Antigen, wodurch sie auch als monospezifisch be-
zeichnet werden. Ferner weisen sie auch konstante Doma-
nen auf. Diese tragen zur Stabilitat der natiirlichen Antikor- 15
per bei. Andererseits sind sie auch fiir unerwiinschte Im-
munreaktionen mitverantwortlich, die entstehen, wenn na-
tiirliche Antikorper verschiedener Tierarten wechselseitig
verabreicht werden.

Zur Vermeidung solcher Immunreaktionen werden Anti- 20
korper konstruiert, denen die konstanten Domanen fehlen.
Insbesondere sind dies Antikorper, die nur noch die varia-
blen Domanen aufweisen. Solche Antikorper werden mit
F v -Antik6rper-Konstrukten bezeichnet. Diese liegen haufig
in Form einzelkettiger, sich miteinander gepaarter Mono- 25
mere vor.

Es hat sich allerdings gezeigt, daB F v - Antikorper- Kon-
strukte nur eine geringe Stabilitat aufweisen. Ihre Verwend-
barkeit fiir therapeutische Zwecke ist daher stark einge-
schrankt. 30

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zu-
grunde, einen Antikorper bereitzustellen, mit dem uner-
wiinschte Immunreaktionen vermieden werden konnen. Fer-
ner soli er eine Stabilitat aufweisen, die ihn fiir therapeuti-
sche Zwecke einsetzbar macht. 35

ErfindungsgemaB wird dies durch die Gegenstande in den
Patentanspriichen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein mul-
tivalentes F v - Antikorper- Konstrukt, das eine groBe Stabilitat
aufweist. Ein solches eignet sich fiir diagnostische und the- 40
rapeutische Zwecke.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen
des Anmelders, daB die Stabilitat eines F v - Antikorper- Kon-
struktes erhoht werden kann, wenn dieses in Form eines ein-
zelkettigen Dimeres vorliegt, bei dem die vier variablen Do- 45
manen iiber drei Peptidlinker miteinander verbunden sind.
Ferner hat der Anmelder erkannt, daB sich das F v - Antikor-
per- Konstrukt mit sich selbst faltet, wenn der mittlere Pep-
tidlinker eine Lange von etwa 10-30 Aminosauren aufweist.
Des weiteren hat der Anmelder erkannt, daB sich das F v - An- 50
tikorper- Konstrukt mit anderen F v - Antikorper- Konstrukten
zusammenfaltet, wenn der mittlere Peptidlinker eine Lange
von etwa bis zu 10 Aminosauren aufweist, wodurch ein
multimeres, d. h. multivalentes, F v -Antik6rper-Konstrukt
erhalten wird. Auch hat der Anmelder erkannt, daB das F v - 55
Antikorper- Konstrukt multispezifisch sein kann.

ErfindungsgemaB werden die Erkenntnisse des Anmel-
ders genutzt, ein multivalentes F v -Antik6rper-Konstrukt be-
reitzustellen, das mindestens vier variable Domanen umfaBt,
die iiber die Peptidlinker 1, 2 und 3 miteinander verbunden 60
sind.

Der Ausdruck "F v - Antikorper- Konstrukt" weist auf einen
Antikorper hin, der variable Domanen, nicht aber konstante
Domanen aufweist.

Der Ausdruck "multivalentes F v - An tikorper- Konstrukt" 65
weist auf einen F v - Antikorper hin, der mehrere variable Do-
manen, jedoch mindestens vier aufweist. Solches wird er-
reicht, wenn sich das einzelkettige F v -Antik6rper-Konstrukt

846 A 1

2

mit sich selbst faltet, wodurch vier variable Domanen gege-
ben sind, oder sich mit anderen einzelkettigen F v - Antikor-
per- Konstrukten zusammenfaltet. In letzterem Fall liegt ein
F v - Antikorper- Konstrukt vor, das 8, 12, 16, etc. variable Do-
manen aufweist. Giinstig ist es, wenn das F v -Antik6rper-
Konstrukt vier oder acht variable Domanen aufweist, d. h.
es ist bi- oder tetravalent (vgl. Fig. 1). Ferner konnen die va-
riablen Domanen gleich oder verschieden voneinander sein,
wodurch das Antikorper- Konstrukt ein oder mehrere Anti-
gene erkennt. Vorzugsweise erkennt das Antikorper- Kon-
strukt ein oder zwei Antigene, d. h. es ist mono- bzw. bispe-
zifisch. Beispiele solcher Antigene sind die Proteine CD 19
und CD3.

Der Ausdruck "Peptidlinker 1,3" weist auf einen Peptid-
linker hin, der geeignet ist, variable Domanen eines F v - An-
tikorper- Konstruktes miteinander zu verbinden. Der Peptid-
linker kann jegliche Aminosauren enthalten, wobei die
Aminosauren Glycin (G), Serin (S) und Prolin (P) bevorzugt
sind. Die Peptidlinker 1 und 3 konnen gleich oder verschie-
den voneinander sein. Ferner kann der Peptidlinker eine
Lange von etwa 0-10 Aminosauren aufweisen. In ersterem
Fall ist der Peptidlinker lediglich eine Peptidbindung aus
dem COOH-Rest einer der variablen Domanen und dem
NH 2 -Rest einer anderen der variablen Domanen. Vorzugs-
weise weist der Peptidlinker die Aminosauresequenz GG
auf.

Der Ausdruck "Peptidlinker 2" weist auf einen Peptidlin-
ker hin, der geeignet ist, variable Domanen eines F v - Anti-
korper- Konstruktes miteinander zu verbinden. Der Peptid-
linker kann jegliche Aminosauren enthalten, wobei die
Aminosauren Glycin (G), Serin (S) und Prolin (P) bevorzugt
sind. Ferner kann der Peptidlinker eine Lange von etwa
3-10 Aminosauren, insbesondere 5 Aminosauren, und ganz
besonders die Aminosauresequenz GGPGS, aufweisen, wo-
durch erreicht wird, daB sich das einzelkettige F v -Antikor-
per-Konstrukt mit anderen einzelkettigen Fv-Antikorper-
Konstrukten zusammenfaltet. Des weiteren kann der Peptid-
linker eine Lange von etwa 11-20 Aminosauren, insbeson-
dere 15-20 Aminosauren, und ganz besonders die Amino-
sauresequenz (G4S)4, aufweisen, wodurch erreicht wird, daB
sich das einzelkettige F v -Antikorper-Konstrukt mit sich
selbst faltet.

Ein erfindungsgemaBes F v -Antikorper-Konstrukt kann
durch iibliche Verfahren hergestellt werden. Giinstig ist ein
Verfahren, bei dem fiir die Peptidlinker 1, 2 und 3 kodie-
rende DNAs mit fiir die vier variablen Domanen eines F v -
Antikorper- Konstruktes kodierenden DNAs ligiert werden
derart, daB die Peptidlinker die variablen Domanen mitein-
ander verbinden, und das erhaltene DNA-Molekiil in einem
Expressionsplasmid exprimiert wird. Es wird auf die Bei-
spiele 1-5 verwiesen. Hinsichtlich der Ausdriicke "Fv-Anti-
korper-Konstrukt" und "Peptidlinker" wird auf vorstehende
Ausfiihrungen verwiesen. Erganzend wird auf Maniatis, T.
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory 1982, verwiesen.

DNAs, die fiir ein erfindungsgemaBes Fv-Antikorper-
Konstrukt kodieren, sind ebenfalls Gegenstand der vorlie-
genden Erfindung. Ferner sind Expressionsplasmide, die
solche DNAs enthalten, auch Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Bevorzugte Expressionsplasmide sind pDISC3 X
19-LL, pDISC3 x 19-SL, pPiC-DISC-LL und pPIC-DISC-
SL. Diese wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung fiir
Mikroorganismen und Zellen) am 30. April 1998 unter
DSM 12150, DSM 12149, DSM 12152 bzw. DSM 12151
hinterlegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
ein Kit, umfassend:

3

DE 198 19 846 A 1

4

(a) ein erfindungsgemaBes F v -Antik6rper-Konstrukt,
und/oder

(b) ein erfindungsgemaBes Expressionsplasmid, sowie

(c) iibliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Losungsmittel und
Kontrollen. 5

Von den einzelnen Komponenten konnen ein oder meh-
rere Vertreter vorliegen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein multivalentes F v - An-
tikorper-Konstrukt bereit, bei dem die variablen Domanen 10
iiber Peptidlinker miteinander verbunden sind. Ein solches
Antikorper-Konstrukt zeichnet sich dadurch aus, daB es
keine Teile enthalt, die zu unerwiinschten Immunreaktionen
fiihren konnen. Ferner weist es eine groBe Stabilitat auf. Des
weiteren ermoglicht es mehrere Antigene gleichzeitig zu 15
binden. Das erfindungsgemaBe F v - Antikorper-Konstrukt
eignet sich daher bestens nicht nur fiir diagnostische, son-
dern auch fiir therapeutische Zwecke verwendet zu werden.
Solche Zwecke konnen hinsichtlich jeder Erkrankung, ins-
besondere einer viralen, bakteriellen oder Tumor- Erkran- 20
kung, gesehen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die genetische Organisation eines erfindungs- 25
gemaBen F v -Antik6rper-Konstruktes (A) und Schemata zur
Bildung eines bivalenten (B) bzw. tetravalenten F v -Antikor-
per-Konstruktes (C). Ag: Antigen; Hiss: sechs C-terminale
Histidinreste; Stop: Stoppcodon (TAA); Vh und Vl: varia-
ble Region der schweren und der leichten Kette. 30

Fig. 2 zeigt das Schema zur Konstruktion der Plasmide
pDISC3 x 19-LL und pDISC3 x 19-SL. c-myc: Sequenz,
kodierend fiir ein Epitop, das von dem Antikorper 9E1 er-
kannt wird, Hiss: Sequenz, die fiir sechs C-terminale Histi-
dinreste kodiert; PelB: Signalpeptidsequenz der bakteriellen 35
Pectatlyase (PelB -Leader); rbs: Ribosomenbindungsstelle;
Stop: Stoppcodon (TAA); Vh und Vl: variable Region der
schweren und der leichten Kette.

Fig. 3 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids
pDISC3 X 19-LL. 6 X His: Sequenz, die fiir sechs C-termi- 40
nale Histidinreste kodiert; bla: Gen, das fiir p-Lactamase ko-
diert, die fiir Ampicillinresistenz verantwortlich ist; bp: Ba-
senpaare; c-myc: Sequenz, kodierend fiir ein Epitop, das
von dem Antikorper 9E10 erkannt wird; ColEl: Origin der
DNA-Replikation; fl-IG: intergenische Region des Bakte- 45
riophagen fl; Lac P/O: wt lac-Operon-Promotor/Operator;
Linker 1: Sequenz, die fiir ein GlyGIy-Dipeptid kodiert, das
die V H - und V L -Domanen verkniipft; Linker 2: Sequenz, die
fiir ein (GIy4Ser) 4 -Polypeptid kodiert, das die hybriden
scFv-Fragmente verkniipft; Pel-B -Leader: Signalpeptidse- 50
quenz der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbin-
dungsstelle; Vh und Vl: variable Region der schweren und
der leichten Kette.

Fig. 4 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids
pDISC3 x 19-SL. 6 x His: Sequenz, die fiir sechs C-termi- 55
nale Histidinreste codiert; bla: Gen, das fiir ppaare; c-myc:
Sequenz, kodierend fiir ein Epitop, das von dem Antikorper
9E10 erkannt wird; ColEl: Origin der DNA-Replikation;
fl-IG: intergenische Region des Bakteriophagen fl; Lac
P/O: wt lac-Operon-Promo tor/Operator; Linker 1: Sequenz, 60
die fiir ein GlyGIy-Dipeptid codiert, das die V H - und V L -
Domanen verkniipft; Linker 3: Sequenz, die fiir ein GlyGI-
yProGlySer-Oligopeptid codiert, das die hybriden scFv-
Fragmente verkniipft; Pel-B-Leader: Signalpeptidsequenz
der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbindungsstelle; 65
V H und V L : variable Region der schweren und der leichten
Kette.

Fig. 5 zeigt die Nukleotid- und die davon abgeleitete

Aminosauresequenz des durch das Expressionsplasmid
pDISC3 X 19-LL kodierten bivalenten F v - Antikorper- Kon-
struktes. c-myc-Epitop: Sequenz, kodierend fiir ein Epitop,
das von dem Antikorper 9E10 erkannt wird; CDR: Komple-
mentaritat bestimmende Region; Geriist: Geriistregion (Fra-
mework-Region); His6-Schwanz, Sequenz, die fiir sechs C-
terminale Histidinreste kodiert; PelB-Leader: Signalpeptid-
sequenz der bakteriellen Pectalyase; RBS: Ribosomenbin-
dungsstelle; Vh und Vl: variable Region der schweren und
der leichten Kette.

Fig. 6 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosau-
resequenz des durch das Expressionsplasmid pDlSC3 X 19-
SL kodierten tetravalenten F v - Antikorper- Konstruktes. c-
myc-Epitop: Sequenz, kodierend fur ein Epitop, das von
dem Antikorper 9E10 erkannt wird; CDR: Komplementari-
tat bestimmende Region, Geriist: Geriistregion (Framework-
Region); His6-Schwanz, Sequenz, die fiir sechs Cterminale
Histidinreste kodiert; PelB -Leader: Signalpeptidsequenz
der bakteriellen Pectalyase; RBS: Ribosomenbindungs-
stelle; V H und V L : variable Region der schweren und der
leichten Kette.

Fig. 7 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosau-
resequenz einer Verbindung zwischen einem Gen, das fiir
eine ct-Faktor-Leadersequenz kodiert, und einem Gen, das
fiir das tetravalente F v - Antikorper-Konstrukt codiert, in dem
Pichia-Expressionsplasmid pPIC-DISC-SL. Alpha-Faktor-
Signal: Leaderpeptidsequenz des Saccharomyces cerevi-
siae-a-Faktor-Sekretionssignals; V H : variable Region der
schweren Kette. Rauten zeigen die Signalspaltstellen an.

Fig. 8 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosau-
resequenz einer Verbindung zwischen einem Gen, das fiir
eine a-Faktor-Leadersequenz kodiert, und einem Gen, das
fiir das bivalente F v - Antikorper-Konstrukt codiert, in dem
Pichia-Expressionsplasmid pPIC-DISC-LL. Alpha-Faktor-
Signal: Leaderpeptidsequenz des Saccharomyces cerevi-
siae-a-Faktor-Sekretionssignals; V H : variable Region der
schweren Kette. Rauten zeigen die Signalspaltstellen an.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele er-
lautert.

Beispiel 1

Konstruktion der Plasmide pDISC3 x 19-LL und pDISC3 x
19-SL zur Expression von bivalenten, bispezifischen bzw.
tetravalenten, bispezifischen F v - Antikorper- Konstrukten in

Bakterien

Die Plasmide pHOG-aCD19 und pHOG- dmOKT3 , wel-
che fiir die scF v -Fragmente codieren, die von dem Hybri-
dom HD37, das fiir menschliches CD 19 (Kipriyanov et al.,
1996, J. Immunol. Meth. 196, 51-62) spezifisch ist, bzw.
von dem Hybridom OKT3, das fiir menschliches CD 3 (Ki-
priyanov et al., 1997, Protein Eng. 10, 445^1-53) spezifisch
ist, abgeleitet sind, wurde zur Konstruktion von Expressi-
onsplasmiden fiir ein einzelkettiges F v -Antik6rper-Kon-
strukt verwendet. Ein PCR- Fragment 1 der V H -Domane von
Anti-CD 19, gefolgt von einem Segment, das fiir einen Gly-
Gly-Linker codiert, wurde unter Verwendung der Primer
DPI, 5'-TCACACA GAATTC TTAGATCTATTAAAGAG-
GAGAAATTAACC, und DP2, 5'- AGCACAC GATAT-
CACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGC, erzeugt
(vgl. Fig. 2). Das PCR- Fragment 1 wurde mit EcoRI und
EcoRV gespalten und mit dem mit EcoRI/EcoRV lineari-
sierten Plasmid pHOG-dmOKT3 ligiert, wodurch der Vek-
tor pHOG19-3 erzeugt wurde. Das PCR-Fragment 2 der V L -
Domane von Anti-CD 19, gefolgt von einem Segment, das
fiir ein c-myc-Epitop und einen Hexahistidinylschwanz co-
diert, wurde unter Verwendung der Primer DP3, 5'-AGCA-

DE 198 19 846 A 1

CAC AAGCTT GGCGGTGATATCTTGCTCACCCAAAC-
TCCA, und DP4, 5 AGC AC ACTCTAG AG AC AC AC A-
GATCT TTAGTGATGGTGATGGTGATGTGAGTTTAG-
G, erzeugt. Das PCR-Fragment 2 wurde mit Hindin und
Xbal gespalten und mit dem durch HindlH/Xbal linearisier- 5
ten Plasmid pHOG-dmOKT3 ligiert, wodurch der Vektor
pHOG3-19 erhalten wurde (vgl. Fig. 2). Das fiir das hybride
scFv-3-19 codierende Gen in dem Plasmid pHOG3-19
wurde mittels PCR mit den Primern Bi3sk, 5-
CAGCCGG CCATG GCGCAGGTGCAACTGCAGCAG to
und entweder Li-1, 5'-TATA-

TACTG CAGCTG CACCTGGCTACCACCAC-
CACCGGAGCCGCCACCACCGCTACCACCGCCGCC-
AGAACCACCACCACCAGCGGCCGCAGCATCAGCC-
CG, zur Erzeugung eines langen flexiblen (GIy4Ser)4-inter- 15
scFv-Linkers (PCR-Fragment 3, vgl. Fig. 2) oder Li-2, 5 -
TATATACTG CAGCTG CACCTGCGACCCTGGGCCAC-
CAGCGGCCGCAGCATCAGCCCG, zur Erzeugung eines
kurzen, starren GGPGS -Linkers (PCR-Fragment 4, vgl. Fig.
2) amplifiziert. Die Expressionsplasmide pDISC3 X 19-LL 20
und pDISC3 X 19-SL wurden durch Ligierung des Ncol/
PvuII-Restriktionsfragments aus pHOG 19-3, umfassend
das Vektorgeriist und die NcoI/PvuII-gespaltenen PCR-
Fragmente 3 bzw. 4 konstruiert (vgl. Fig. 3,4). Die vollstan-
dige Nukleotid- und Proteinsequenzen der bivalenten bzw. 25
tetravalenten F v -Antik6rper-Konstrukte sind in den Fig. 5
bzw. 6 angegeben.

Bei spiel 2

Konstruktion der Plasmide pPIC-DISC-LL und pPIC-
DISC-SL zur Expression von bivalenten, bispezifischen
bzw. tetravalenten, bispezifischen F v -Antikorper-Konstruk-

ten in Hefe

(A) Konstruktion von pPIC-DISC-SL

(B) Konstruktion von pPIC-DISC-LL

30

35

Der Vektor pPICZaA (Invitrogen B V, Leek, Niederlande)
zur Expression und Sekretion von rekombinanten Proteinen
in der Hefe Pichia pastoris wurde als Ausgangsmaterial ver- 40
wendet. Er enthalt ein Gen, das fiir das S accharomyces cere-
visiae a-Faktor-Sekretionssignal codiert, gefolgt von einem
Poly linker. Die Sekretion dieses Vektors beruht auf dem do-
minanten selektierbaren Marker, Zeocin™, der sowohl in
Pichia als auch in E. coli bifunktionell ist. Das Gen, das fiir 45
das tetravalente F v -Antik6rper-Konstrukt (scDia-SL) co-
diert, wurde mittels PCR von der Matrize pDISC3 X 19-SL
unter Verwendung der Primer 5-PIC, 5-
CCGT GAATTC CAGGTGCAACTGCAG-
CAGTCTGGGGCTGAACTGGC, und pSEXBn 5'- 50
GGTCGACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG
amplifiziert. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit
EcoRI und Xbal gespalten und in mit EcoRUXbal lineari-
siertes pPICZaA ligiert. Es wurde das Expressionsplasmid
pPIC-DISC-SL erhalten. Die Nukleotid- und Proteinsequen- 55
zen des tetravalenten F v -Antik6rper-Konstruktes sind in
Fig. 7 gezeigt.

60

Die Konstruktion von pPIC-DISC-LL wurde auf der
Grundlage von pPICZocA (Invitrogen BV, Leek, Nieder-
lande) und pDISC3 X 19-LL (vgl. Fig. 3) durchgefuhrt. Die
Plasmid-DNA pPICZaA wurde mit EcoRI gespalten. Die
uberstehenden 5'-Enden wurden unter Verwendung eines 65
Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase I aufge-
fiillt. Die so erhaltene DNA wurde mit Xbal gespalten, und
das groBe Fragment, umfassend den pPIC- Vektor, wurde

isoliert. Analog wurde die DNA von pDISC3 X 19-LL mit
Ncol gespalten und mit einem Klenow-Fragment behandelt.
Nach der Spaltung mit Xbal wurde ein kleines Fragment,
umfassend ein fiir den bivalenten F v -Antik6rper kodieren-
des Gen, isoliert. Dessen Ligierung mit einer pPIC-abgelei-
teten Vektor-DNA ergab das Plasmid pPIC-DISC-LL. Die
Nukleotid- und Proteinsequenz des bivalenten F v -Antik6r-
per-Konstruktes sind in Fig. 8 gezeigt.

Beispiel 3

Expression des tetravalenten bzw. bivalenten F M -Antik6r-
per-Konstruktes in Bakterien

E. coli-XLl-Blue-Zellen (Stratagene, La Jo 11a, CA), die
mit den Expressionsplasmiden pDISC3 x 19-LL bzw.
pDISC3 X 19-SL transformiert worden waren, wurden iiber
Nacht in 2xYT-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin und
100 mM Glucose (2xYT Ga ) bei 37°C geziichtet. 1 : 50-Ver-
diinnungen der Ubernachtkulturen in 2xYT GA wurden als
Kolbenkulturen bei 37°C unter Schutteln mit 200 UpM ge-
ziichtet. Als die Kulturen einen ODgoo-Wert von 0,8 erreicht
hatten, wurden die Bakterien durch lOminiitige Zentrifuga-
tion mit 1500 g bei 20°C pelletiert und in dem gleichen Vo-
lumen eines frischen 2xYT- Mediums, das 50 ug/ml Ampi-
cillin und 0,4 M Saccharose enthielt, resuspendiert. IPTG
wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt,
und das Wachstum wurde bei Raumtemperatur (20-22°C)
18-20 h fortgesetzt. Die Zellen wurden durch lOminiitige
Zentrifugation mit 5000 g bei 4°C geerntet. Der Kulturiiber-
stand wurde zuriickgehalten und auf Eis gelagert. Um die
loslichen periplasmatischen Proteine zu isolieren, wurden
die pelletierten Bakterien in 5% des Anfangsvolumens an
eiskalter 50 mM Tris-HCI, 20% Saccharose, 1 mM EDTA,
pH 8,0, resuspendiert. Nach einer 1 stiindigen Inkubation
auf Eis unter gelegentlichem Riihren wurden die Spharopla-
sten mit 30.000 g 30 min bei 4°C zentrifugiert, wobei der
losliche periplasmatische Extrakt als Uberstand und die
Spharoplasten mit dem unloslichen periplasmatischen Ma-
terial als Pellet erhalten wurden. Der Kulturiiberstand und
der losliche periplasmatische Extrakt wurden vereinigt,
durch weitere Zentrifugation (30.000 g, 4°C, 40 min) ge-
klart. Das rekombinante Produkt wurde durch Ammonium-
sulfatfallung (Endkonzentration 70% Sattigung) eingeengt.
Das Proteinprazipitat wurde durch Zentrifugation (10.000 g,
4°C, 40 min) gewonnen und in 10% des Anfangsvolumens
an 50 mM Tris-HCI, 1 M NaCl, pH 7,0, aufgelost. Eine im-
mobilisierte Metallafflnitatschromatographie (IMAC)
wurde bei 4°C unter Verwendung einer 5 ml Saule an chela-
tierender Sepharose (Pharmacia), die mit Cu 2+ beladen war
und mit 50 mM Tris-HCI, 1 M NaCl, pH 7,0 (Startpuffer)
equilibriert worden war, durchgefuhrt. Die Probe wurde
durch ihr Leiten iiber die Saule aufgeladen. Sie wurde dann
mit zwanzig Saulenvolumina Startpuffer, gefolgt von Start-
puffer mit 50 mM Imidazol, bis die Absorption bei 280 nm
des Effluenten minimal war, gewaschen (etwa dreiBig Sau-
lenvolumina). Das absorbierte Material wurde mit 50 mM
Tris-HCI, 1 M NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,0, eluiert.

Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-
Farbstoffbindungstest (1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)
unter Verwendung des Bio-Rad(Miinchen, Deutschland)-
Proteinas say kits bestimmt. Die Konzentrationen der gerei-
nigten tetravalenten bzw. bivalenten F v -Antik6rper-Kon-
strukte wurden aus den A 2 8o-Werten unter Verwendung der
Extinktionskoefflzienten e lm s /ml = 1,96 bzw. 1,93 bestimmt.

DE 198 19

7

Bei spiel 4

Expression des tetravalenten bzw. bivalenten Antikorper-
Konstruktes in der Hefe Pichia pas tons

5

Kompetente P. pastoris GS155-Zellen (Invitrogen) wur-
den in Gegenwart von 10 pg Plasmid-DNA von pPIC-
DISC-LL bzw. pPIC-DISC-SL, die mit Sacl linearisiert
worden war, elektroporiert. Die Transformanten wurden 3
Tage bei 30°C auf YPD-Platten, die lOOpg/ml Zeocin™ 10
enthielten, selektiert. Die Klone, die bivalente bzw. tetrava-
lente F v -Antik6rper-Konstrukte sezernierten, wurden durch
Plattenscreening unter Verwendung eines anti-c-myc-mAk
9E10 (IC Chemikalien, Ismaning, Deutschland) selektiert.

Zur Expression der bivalenten bzw. tetravalenten F v -An- 15
tikorper-Konstrukte wurden die Klone in YPD -Medium in
Schiittelkolben 2 Tage bei 30°C unter Riihren geziichtet. Die
Zellen wurden zentrifugiert, in dem gleichen Volumen des
Mediums, das Methanol enthielt, resuspendiert und weitere
3 Tage bei 30°C unter Riihren inkubiert. Die Uberstande 20
wurden nach der Zentrifugation gewonnen. Das rekombi-
nante Produkt wurde durch Ammoniums ulfatfallung, ge-
folgt von IMAC, wie vorstehend beschrieben, isoliert.

Beispiel 5 25

846 A 1

8

1 mM Pyruvat supplementiert war, bei 37°C in einer be-
feuchteten Atmosphare mit 7,5% CO2 inkubiert. Die cytoto-
xischen T-Zell-Tests wurden in RPMI- 1 640-Medium, das
mit 10% FCS, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Py-
ruvat und 0,05 mM 2-ME supplementiert war, durchgefuhrt.
Die cytotoxische Aktivitat wurde unter Verwendung eines
Standard [ 51 Cr]-Freisetzungstests bewertet; 2 X 106 Zielzel-
len wurden mit 200 uCl Na[ 51 Cr]04 (Amersham-Buchler,
Braunschweig, Deutschland) markiert und 4mal gewaschen
und anschlieBend in Medium in einer Konzentration von 2 X
10 5 /ml resuspendiert. Die Effektorzellen wurden auf eine
Konzentration von 5 X 10 6 /ml eingestellt. Zunehmende
Mengen an CTLs in 100 jul wurden auf 104 Zielzellen/Ver-
tiefung in 50 ul titriert. 50 ul Antikorper wurden jeder Ver-
tiefung zugesetzt. Der gesamte Test wurde dreifach ange-
setzt und 4 h bei 37°C inkubiert. 100 ul des Uberstands wur-
den gewonnen und auf [ 51 Cr]-Freisetzung in einem gamma-
Zahler (Cobra Auto Gamma; Canberra Packard, Dreieich,
Deutschland) getestet. Die maximale Freisetzung wurde
durch Inkubation der Zielzellen in 10% SDS bestimmt, und
die spontane Freisetzung wurde durch Inkubation der Zellen
in Medium allein bestimmt. Die spezifische Lyse (%) wurde
berechnet als: (experimentelle Freisetzung spontane Frei-
setzung)^- maximale Freisetzung - spontane Freisetzung) X
100.

Charakterisierung des tetravalenten bzw. bivalenten F v -An-

tikorper-Konstruktes

(A) GroBenausschluBchromatographie 30

Eine analytische Gelfiltration der F v - Antikorper- Kon-
strukte wurde in PBS unter Verwendung einer Superdex-
200-HR10/30-Saule (Pharmacia) durchgefuhrt. Das Proben-
volumen und die FlieBgeschwindigkeit betrugen 200 ul/min 35
bzw. 0,5 ml/min. Die Saule wurde mit hoch- und niedermo-
lekularen Gelfiltrations-Kalibrationskits (Pharmacia) kali-
briert.

(B) DurchfluBzytometrie 40

Die menschliche CD3 + /CD19"-akute-T-Zell-Leukamieli-
nie Jurkat und die CD19 + /-CD3--B-Zellinie JOK-1 wurden
fiir die DurchfluBzytometrie verwendet. 5 X 10 5 Zellen in
50 ul RPMI 1 640-Medium (GIBCO BRL, Eggestein, 45
Deutschland), das mit 10% FCS und 0,1% Natriumazid sup-
plementiert war (als vollstandiges Medium bezeichnet),
wurden mit 100 ul der F v -Antik6rper-Praparate 45 min auf
Eis inkubiert. Nach Waschen mit dem vollstandigen Me-
dium wurden die Zellen mit 100 ul 10 ug/ml anti-c-myc- 50
Mak 9E10 (IC Chemikalien) in dem gleichen Puffer 45 min
auf Eis inkubiert. Nach einem zweiten Waschzyklus wurden
die Zellen mit 100 ul des FITC-markierten Ziege-anti-
Maus-IgG (GIBCO BRL) unter den gleichen Bedingungen
wie vorher inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut gewa- 55
schen und in 100 ul 1 ug/ml- Propidiumiodid-Losung
(Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in vollstandigem Me-
dium unter AusschluB von toten Zellen resuspendiert. Die
relative Fluoreszens der gefarbten Zellen wurde unter Ver-
wendung eines FACScan-DurchfluBzytometers (Becton 60
Dickinson, Mountain View, CA) gemessen.

(C) Cytotoxizitatstest

Die CD19-exprimierende Burkitt-Lymphoma-Zellinie 65
Raji und Namalwa wurden als Zielzellen verwendet. Die
Zellen wurden in RPMI 1640 (GIBCO BRL), das mit 10%
hitzeinaktiviertem FCS (GIBCO BRL), 2 mM Glutamin und

Patentanspruche

1. Multivalentes F v - Antikorper- Konstrukt mit minde-
stens vier variablen Domanen, die iiber die Peptidlin-
ker 1, 2 und 3 miteinander verbunden sind.

2. F v -Antik6rper-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei
die Peptidlinker 1 und 3 0-10 Aminos auren aufweisen.

3. F v -Antik6rper-Konstrukt nach Anspruch 2, wobei
die Peptidlinker 1 und 3 die Aminosauresequenz GG
aufweisen.

4. F v -Antikorper- Konstrukt nach einem der Ansprii-
che 1-3, wobei das F v - Antikorper- Konstrukt bivalent
ist.

5. F v - Antikorper- Konstrukt nach Anspruch 4, wobei
der Peptidlinker 2 11-20 Aminosauren aufweist.

6. F v - Antikorper- Konstrukt nach Anspruch 4 oder 5,
wobei der Peptidlinker 2 die Aminosauresequenz
(G4S)4 aufweist.

7. Fy-Antikorper-Konstrukt nach einem der Ansprii-
che 1-3, wobei das F v - Antikorper- Konstrukt tetrava-
lent ist.

8. F v - Antikorper- Konstrukt nach Anspruch 7, wobei
der Peptidlinker 2 3-10 Aminosauren aufweist.

9. F v -Antikorper- Konstrukt nach Anspruch 7 oder 8,
wobei der Peptidlinker 2 die Aminosauresequenz
GGPGS aufweist.

10. F v - Antikorper- Konstrukt nach einem der Ansprii-
che 1-9, wobei das F v - Antikorper- Konstrukt multispe-
zifisch ist.

11. F v - Antikorper- Konstrukt nach Anspruch 10, wo-
bei das F v - Antikorper- Konstrukt bispezifisch ist.

12. F v - Antikorper- Konstrukt nach einem der Ansprii-
che 1-9, wobei das F v - Antikorper- Konstrukt monospe-
zifisch ist.

13. Verfahren zur Herstellung des multivalenten F v -
Antikorper-Konstruktes nach einem der Anspriiche
1-12, wobei fur die Peptidlinker 1, 2 und 3 kodierende
DNAs mit fiir die vier variablen Domanen eines F v - An-
tikorper- Konstruktes kodierenden DNAs ligiert wer-
den derart, daB die Peptidlinker die variablen Domanen
miteinander verbinden, und das erhaltene DNA-Mole-
kiil in einem Expressionsplasmid exprimiert wird.

30

40

DE 198 19 846 A 1

14. Expressionsplasmid, kodierend fur das multiva-
lente F v -Antik6rper-Konstrukt nach einem der Ansprii-
che 1-12.

15. Expressionsplasmid nach Anspruch 14, namlich
pDISC3 x 19-LL. 5

16. Expressionsplasmid nach Anspruch 14, namlich
pDISC3 x 19-SL.

17. Expressionsplasmid nach Anspruch 14, namlich
pPIC-DISC-LL.

18. Expressionsplasmid nach Anspruch 14, namlich 10
pPIC-DISC-SL.

19. Verwendung des multivalenten F v -Antik6rper-
Konstruktes nach einem der Anspriiche 1-12 zur Dia-
gnose und/oder Therapie von Erkrankungen.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Erkran- 15
kungen virale, bakterielle oder Tumor-Erkrankungen
sind.

Hierzu 8 Seite(n) Zeichnungen

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ZEICHNUNGEN SEITE 1

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846 A1
C07K 16/00

11. November 1999

A

Promoter

V H -A

Leader

V L -B V H -B

Linker 1

V L -A

^ ^ T T

His 6

!i;i;iS iMTmnf

Epitop 8-

Linker 3

Linker 2

His 6

FIGUR 1

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 2

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846 A1
C07K 16/00

11. November 1999

pHOG-ocCD19

pHOG-dmOKT3

^DP 1
EcoRI

N DP3
Hindlll EcoRV

CL
O

rbs PelB

j_jj s co Xbal EcoRI

Hindlll EcoRV

L

CL
O

Vu3S

EcoRI

EcoRI

EcoRI

PCR 1

DP2

c-myc qp4^

PCR 2

rbs PelB

akttpKLEEGEFSEARV

t Hiss

c-myc

fTTTTTT

Xbal

EcoRI/EcoRV

pHOG1 9-3

Ncol PvuII

L1

Hindlll/Xbal

Xbal
U

Ecofl/

PHOG3-1 9

Bi3sk

Xbal
iiiimnj— i

LI

PCR

U-2

PCR 4

Ncol

PvuII Ncol

Ncol/Pvuli

Ncol/Pvuli

pDISC3x19-LL

His Xbal

rbs PelB i_1 L2 L1 c-myc §•

pDISC3x19-SL

EcoRI

rbs PelB

His 6

L1 L3 L1 c - m y° o

Linkers: L1 = GG

L2 = (G 4 S) 4
L3 = GGPGS

FIGUR 2

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 3

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846 A1
C07K 16/00

11. November 1999

Lac P/O

FIGUR 3

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 4

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE198 19 846A1
C07K 16/00

11. November 1999

Lac P/O

3

FIGUR 4

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 5

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846 A1
C07K 16/00

11. November 1999

EcoRI RBS PelB leader N C0 |

1 GAATTCATTAAAGAQG

1> M KYLLPTAAAGLLLLAAQPAM
♦ Frame-H1 VH anti-CD3

92 CGCAGGTGCAACTGCAGCAG

22>A QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFT
CDR-H1 Frame-H2 CDR-H2

183 TAGGTACACGATGCACT GGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGG^
52 ► R Y T M H WVKQRPGQGLEWIGY I N P S R G Y T

Frame-H3

267 TAATTAC AATCAGAAGTTC AAGGACA AGGCCACATTGACTACAGACAAATC APTCAry AGCCTGAC

80> N Y N Q K F K D KATLTTDKSSSTAYMQLSSLT

CDR-H3 Frame-H4

354 ATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAA

109> SEDSAVYYCARY Y D D H Y S L D YWGQGTTL

CH1 • Linker 1 Frame-L1 VL anti-CD19

44 0 CAGTCTCCTX ^GCCAAAACAACACCCA AGCTTg^

138^T VSSAKTTPK-LG GDILLTQTPASLAVSLGQ

CDR-L1 Frame-L2
530 GGGCCACCATX^TCCTGC JVAGGCCAGCCA^

168* RATISC K A S Q S V D Y D G D S Y L,N WYQQ I PG

CDR-L2 Frame-L3

614 AGCCACCCAAACTCCTCATCTATG AT G C AT C CAATC TAGTTTC TGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGC&GT^

196>Q PPKLLIY D A S N L V S GIPPRFSGSGSGTDF

CDR-L3 Frame-L4

702 CACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCA^

225> TLNIHPVEKVDAATYHCQ Q S T E D PWTFGG

C kappa Not! Linker 2

790 GGCACCAAGCTGGAAATCAA ACGGGCTGATGCTG CQ

25S> GTKLEIKRADAAAAG G G G S G G G G S G G G G

Pvull Frame-H1 VH anti-CD19

87 4 . TCCGGTGG TGG TG G TA GCCAGCHX]£AGCTGCAGCAG

283 S G G G G S Q VQLQQ SGAELVRPGS SVKI S CK

CDR-H1 Frame- H2 CDR-H2

962 CTTCTGGCTATGCATTCAGT AG CTAC TG GATGAACT GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTC

312> A SGYAFS S Y W M NWVKQRPGQGLEWIGQ I W

PstI Frame-H3

1049 CTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTA AAGCCACTCT^
341>P G D G D T. N Y NG K F K GKATLTADESSSTAY

CDR-H3

1133 TGCAACTCAGGAXXICTAGCATCTGAGGACTC GAC GGTAGGC C GTT ATTACTAT

369>M QLS SLAS EDSAVYFCAR R E T T T VG R Y Y Y

Frame-H4 CH1 Linker 1 Frame-L1

1219 G C TAT G GAC TACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC^ GGC GGTGATATCGTGCTCACTC

398> A M D YWGQGTSVTVSSAKTTPKLG GDIVLT
VL anti-CD3 CDR-L1

1307 AGTGTCCAGCAATCA1GTCTGCATCTCCAQ
427^Q SPAIMSASPGEKVTMTCS A S S S V S Y MNW

Frame-L2 CDR-L2 Frame-L3

13 93 TACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGAT^
456> YQQKSGTSPKRWIY D T S K L A S GVPAHFRG

CDR-L3

1481 GTGGGTCTGGGACCTCTTACTC G GAG TAG T AA

485^S GSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQ Q W S S N

Frame-L4 C kappa c-myc epitope

1569 CCCATTCACGT TCGGCTCGGGGACAAAGTTGG^
514> P F TFGSGTKLEINRADTAPTGSE Q K L I S

His6 tail Xbal
1655 AA GAAGA CCTAAACTCACATCACCATCACCATCACT AATCTAGA
543>E E D LNSHHHHHH •

FIGUR 5

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 6

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846A1
C07K 16/00

11. November 1999

EcoRI FIBS PelB leader N CO |

1 GAATTCATTAAAGAG^

1> M KYLL PTAAAGLLLLAAQ PAM
♦ Frame-H1 VH anti-CD3

92 CG£7\GGTGCAACTGCAGCAGTCTC

22>AQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFT
CDR-H1 Frame-H2 CDR-H2

183 TAGGTAC AC GAT GC ACT GGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATG^^ TAGC C GTGGTT AT AC

52> R Y T M HWVKQRPGQGLEWIGY I N P S RG Y T

Frame-H3

2 67 TAATTACAATCAGAAGTTGAAGGACA AGGCCACATTGACTACAGACAAATCC
S0> N Y N Q K F K DKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT

CDR-H3 Frame-H4

354 ATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGIGCA^

109> SEDSAVYYC'ARY Y D D H Y S L D Y WGQGTTL

CH1 Linker 1 Frame-L1 VL anti-CD 19

440 CAGTCTCCTCA GCCAAAACAACACC^

138^T VSSAKTTPKLG GDILLTQTPASLAVSLGQ

CDR-L1 Frame-L2
530 GGGCCACCATCTCCTGC AA G G C CAGC C AAA GT GT T GAT T AT G AT G GTG AT AG T TAT T T G AACT GGTACCAACAGATTCCAGGAC
16S> RATISC.KA S Q S VD Y DG D S Y LNWYQQIPG

CDR-L2 Frame-L3
614 AGCCACCCAAACTCCTCATCTAT GATGC ATC CA&TC T A GT T T C TG GGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTG

196>Q PPKLLIYD A S N L V S GIPPRFSGSGSGTDF

CDR-L3 Frame-L4

702 CACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCA^

225> TLNIHPVEKVDAATYHCQ Q S T E DPWTFGG

C kappa Not I Linker 3 Pvul! Frame-H1

790 GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCGG^ CA GGGTCGCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCT

255 ► GTK LEIKRAD AAAA G G P G S QVQLQQSGAEL

VH anti-CD19 CDR-H1 Frame-H2

879 GGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGG

284> VRPGSSVKISC KASGYAFS S Y W M NWVKQR

CDR-H2

968 CTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGG ACAGATTTGGCCT

314^P GQGLEWIGQ I W P GD G D TNYNG K F KGKA

Frame-H3

1051 ACTCTCACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCT
342 ► TLTADES SSTAYMQLSSLASEDSAVYFCAR

CDR-H3 Frame-H4 CH1

1142 GGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC
372>R E T T T V G R Y Y Y A M D Y WGQGTSVTVSSAK

Linker 1 Frame-Ll VL anti-CD3

122 6 C AACACCC A AGCTT G<?C G G TGATATCGTGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCAT^
400>T TPKLG G D IVLTQS PAIMSAS PGEKVTMTC

CDR-L1 Frame~L2 CDR-L2

1316 G T G C CAGC T CAAG T G T AAG TT AC AT G AACT CK5TACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATQ G AC AT C C AA

430>S A S S S V S YMNWYQQKSGTSPKRWIYD T S K

Frame-L3

1401 AC T G G C T T C TGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGG
458> L A S GVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDA

CDR-L3 Frame-L4 C kappa

1491 TGCCACTTATTACTGC CAGCAGTG G AG T AGT AAC C CAT T C AC GT TCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAC CGGGCTGATACTGC
488^ ATYYCQ Q W S S N P F TFGSGTKLEINRADTA

c-myc epitope His6 tail Xbal

1578 ACCAACTG GATCC GAACAAAAGCTGA TCTCA GAA GAA GA CC TAAACTCACia TCACCATCACC^TCAC T AATCTAGA
517 ► PTGS E, Q K L I S E E D LNSHHHHHH •

FIGUR 6

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 7

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846 A1
C07K 16/00

11. November 1999

941 ATGAGATTTCCTTCAATTT^

1> M RFPSI FTAVLFAASSALAAPVNTT

alpha-factor signal

1015 AACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAG

25 ► TEDETAQI PAEAVI GYSDLEGDFD

1089 TTGCTGTTTTGCCATTTTC

50>V AVLPFSNSTNNGLLF 1 NTT I AS I A

1163 GCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAG

75>AKEEGVSLEKREAEAEFQV Q L QQS

VH anti-CD3

1234 TGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT
98> GAELARPGASVKMSCKAS

EcoRI

Xhol

♦

FIGUR 7

902 045/241

ZEICHNUNGEN SEITE 8

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 198 19 846A1
C07K 16/00

11. November 1999

941 ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTC

J> M R F P S I FTAVLFAASSALAAPVNTT

alpha-factor signal

1015 AACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCC

25 ► TEDETAQI PAEAVI GYSDLEGDFD

BsrDI

1089 TTGCTGTTTTGCCATTTTC

50^V AVLPFSNSTNNGLLF I NTT I AS I A

1163 GCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGM^TC ATGGCGC AG G T G CAAC TGCAG
75 ► AKEEGVSLEKREAEAEFMA Q V Q L Q

VH anti-CD3

1235 CAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT

99> QSGA ELARPGASVKMSCKAS

EcoRI

Xhol

♦

FIGUR 8

902 045/241